国自然申请之lncRNA与m6A联合研究

非编码RNA研究，特别是lncRNA研究是近几年国自然研究热点之一，围绕着它展开的转录调控和转录后调控研究一直层出不穷。正所谓“盛极必衰”，在追求一定创新性的国自然申请中，如果继续沿用之前的研究老套路，设计的标书势必会成为“分母”中的一员。那么如何在我们熟悉的研究套路中加入新的元素，今天要给大家分享的是一篇国自然项目研究成果文章“LNC942 promoting METTL14-mediated m6A methylation in breast cancer cell proliferation and progression”，文章将我们熟知的lncRNA研究与近几年的国自然研究新宠儿“m6A甲基化修饰”联系了起来。我们基于这篇文章，拟写了国自然申请中该类新老热点联合研究的标书，大家也可以照着这种方式开始着手练习标书写作。

1.   立项依据

1.1 研究意义

m6A甲基化是包括mRNA和ncRNA（即非编码RNA，包括miRNA，rRNA，circRNA和lncRNA等）在内的所有RNA最普遍的表观遗传修饰。在病理过程中，m6A甲基化积极参与肿瘤发生和发展过程中肿瘤细胞功能和特性的维持。已有研究表明m6A甲基化修饰的lncRNA在多种肿瘤中能够通过RNA-蛋白结合，ceRNA机制或RNA-RNA结合的形式显著影响靶基因的功能。然而肿瘤中lncRNA调节m6A甲基化相关蛋白从而影响靶基因表达进而影响肿瘤发生发展的机制尚不明确。因此，阐明肿瘤发生发展过程中lncRNA和m6A甲基化介导的转录后调控模式至关重要。

1.2 METTL14功能研究

m6A甲基化修饰主要由m6A甲基化转移酶，m6A去甲基化酶以及m6A甲基化阅读蛋白共同参与。其中METTL14是m6A甲基转移酶的关键组分，可以通过调节RNA前体的剪接和输出，蛋白质的翻译和miRNA的成熟过程等影响RNA的稳定性或降解RNA。已有研究表明METTL14的异常表达与多种肿瘤的细胞增殖、分化、侵袭和凋亡密切相关。有报道称在乳腺癌（BRCA）细胞中，METTL14通过调节上皮-间质转化关键mRNA的m6A甲基化水平影响细胞增殖，侵袭和血管生成，从而发挥促癌作用。然而，也有报道称METTL14在肝癌、膀胱癌、子宫内膜癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达下调，发挥抑癌作用。例如在肝癌中，低表达的METTL14及相应的低水平m6A修饰，显著提高肝癌细胞的转移能力。lncRNA作为长链非编码RNA，其作用机制主要有两种，分别是转录水平调控和转录后水平调控，已有研究表明lncRNA上普遍存在m6A修饰。在以往的研究主要集中在METTL14影响mRNA的稳定性和翻译，然而对于肿瘤发生发展过程中lncRNA是否参与调节METTL14功能的研究甚少。

1.3 LNC942促进METTL14介导的m6A甲基化

为分析BRCA中lncRNA是否参与调节METTL14的功能，研究人员进行了如下前期研究（预实验）：

1）利用Affymetrix表达谱芯片检测BRCA细胞系和正常乳腺上皮细胞系之间差异表达的lncRNA，筛选到高表达lncRNA LNC942；

2）检测各BRCA细胞系中LNC942的表达量，确定LNC942高表达细胞系MCF7和LNC942低表达细胞系SKBR4。

3）利用ENCORI网站预测与LNC942直接结合的蛋白，发现m6A甲基化相关蛋白显著富集，m6A斑点印迹分析各细胞系中m6A甲基化水平。敲减LNC942，分析m6A相关蛋白表达变化，发现METTL14下调最明显。

4）敲减/过表达LNC942，qPCR以及WB检测到METTL14 mRNA和蛋白水平变化，结果显示mRNA和蛋白水平均下降；

5）敲减LNC942结合转录抑制剂处理，分析METTL14mRNA半衰期变化，结果显示敲减LNC942能够加速METTL14mRNA降解的速度，表明LNC942影响METTL14mRNA的稳定性。

6）利用tartaglialab网站预测LNC942和METTL14的结合位点。

7）对芯片结果中LNC942的共表达靶基因进行KEGG富集分析，筛选肿瘤相关功能基因，并利用ENCORI网站预测含有METTL14介导的m6A甲基化修饰特异性识别基序UGCCA/AGCC的候选基因，确定靶基因CXCR4和CYP1B1。

8）敲减/过表达LNC942，qPCR和WB分析CXCR4和CYP1B1 mRNA和蛋白水平变化，结果显示敲减LNC942，CXCR4和CYP1B1 mRNA和蛋白水平均下降。

综上所述，基于国内外研究进展与课题组前期研究基础，研究人员提出如下科学假说：BRCA中高表达的LNC942可能是通过促进m6A甲基化转移酶METTL14 mRNA的稳定性，上调METTL14 mRNA和蛋白表达，进而上调下游靶基因CXCR4和CYP1B1的表达，促进BRCA的进展。

2. 研究内容

2.1 LNC942对BRCA细胞特性的影响

1）敲减/过表达MCF7和SKBR4细胞系的LNC942，利用MTT实验、集落形成实验、Transwell实验以及流式细胞术检测细胞增殖、集落形成、迁移和凋亡的变化。（敲减LNC942，细胞增殖、集落形成和迁移能力显著被抑制，凋亡率明显升高，过表达LNC942则出现相反表型）

2.2 LNC942与METTL14及m6A相关性分析

1）敲减METTL14，分析LNC942表达变化；（LNC942表达无变化，提示LNC942可能作为METTL14上游调控因子行使功能，预实验中已经证明LNC942影响METTL14的表达）

2）利用RNA原位杂交(ISH)和免疫组织化学(IHC)检测大量BRCA组织（n=150）中LNC942、METTL14及m6A表达情况及表达相关性；（结果显示LNC942、m6A和METTL14在BRCA组织中高表达，LNC942与METTL14表达正相关，LNC942与m6A水平正相关）

3）皮尔逊χ2检验和非条件回归分析LNC942、m6A和METTL14与临床病理特征和分子特征（肿瘤浸润、肿瘤大小以及p63）相关性。

2.3 LNC942通过调节METTL14影响m6A甲基化修饰

1）免疫荧光（IF）分析敲减/过表达LNC942后，METTL14蛋白水平变化；（预实验分析了敲减/过表达LNC942，METTL14 mRNA水平变化，并用WB检测了蛋白水平变化，这里是进一步验证METTL14蛋白水平的变化） 

2）m6A斑点印迹分析敲减LNC942后，细胞整体m6A甲基化水平变化。（结果显示敲减LNC942，m6A整体水平降低，将LNC942与m6A甲基化水平联系起来） 

2.4 BRCA细胞中LNC942与METTL14相互作用关系

1）在LNC942敲减细胞中过表达METTL14进行功能回复实验，利用MTT实验、集落形成实验、Transwell实验以及流式细胞术检测细胞增殖、集落形成、迁移和凋亡的变化；（结果显示过表达METTL14能逆转LNC942敲减引起的细胞表型变化）

2）RNA原位杂交(ISH)结合免疫荧光（IF）对细胞中LNC942和METTL14的表达进行共定位分析；（结果显示细胞中LNC942和METTL14的表达位置一致，提示LNC942和METTL14在细胞中可能存在结合关系）

3）RNA pull-down实验分析细胞中LNC942和METTL14的结合情况。（进一步验证LNC942和METTL14的结合关系）（这里缺少了LNC942和METTL14对于m6A甲基化水平影响的研究）

2.5 METTL14下游靶基因分析

1）各BRCA细胞系中分析CXCR4和CYP1B1表达情况；（结果显示CXCR4和CYP1B1在各BRCA细胞系中均高表达）

2）敲减LNC942结合转录抑制剂处理，分析CXCR4和CYP1B1 mRNA半衰期变化；（结果显示敲减LNC942，CXCR4和CYP1B1 mRNA降解加速，提示LNC942影响CXCR4和CYP1B1的mRNA稳定性）

2.6 LNC942-METTL14-CXCR4/CYP1B1信号轴分析

1）敲减LNC942并过表达METTL14进行功能回复实验，分析CXCR4和CYP1B1 mRNA和蛋白水平变化；（结果显示METTL14过表达能消除LNC942敲减引起的靶基因表达下降，分析确定LNC942、METTL14和CXCR4/CYP1B1之间的靶向关系）

2）敲减LNC942并过表达METTL14进行功能回复实验，m6A斑点印迹分析检测m6A甲基化水平变化；（结果显示功能回复后，m6A甲基化水平显著升高，确定LNC942、METTL14与6A甲基化水平相关性）（这里缺少了对于CXCR4和CYP1B1的mRNA m6A甲基化水平的检测，如果添加上这一步，结果会更加完整及严谨）

3）过表达METTL14，分析CXCR4和CYP1B1表达变化；（结果显示过表达METTL14显著提高CXCR4和CYP1B1表达水平，确定METTL14与CXCR4/CYP1B1之间的靶向关系）

4）免疫组化（IHC）分析BRCA组织中CXCR4和CYP1B1表达情况；（结果显示BRCA组织中CXCR4和CYP1B1高表达，进一步确定CXCR4和CYP1B1是BRCA密切相关，是LNC942靶基因）

5）分析CXCR4、CYP1B1与LNC942、m6A和METTL14表达相关性。

2.7 体内实验验证

1）共转染稳定表达shNC，shLNC942， shLNC942 + NC， shLNC942+pcDH-METTL14的MCF7细胞，构建异种移植瘤小鼠模型，40天后分析肿瘤体积和重量的变化；

2）qPCR结合IHC分析各肿瘤块中CXCR4、CYP1B1和METTL14的表达情况。

3.   技术路线

图注：图中灰色部分为预实验内容

4. 研究目标

4.1 阐明BRCA中LNC942参与调节METTL14的表达及mRNA稳定性。

4.2 阐明BRCA中LNC942通过结合METTL14调节其功能，影响整体m6A水平。

4.3 阐明LNC942通过METTL14的下游靶点CXCR4和CYP1B1影响BRCA进展。

5. 特色与创新之处

5.1 文章最大的创新点在于将lncRNA与m6A进行了联合分析，即摆脱了lncRNA俗套的ceRNA调控机制研究，又牢牢抓住了近几年国自然的热点—m6A修饰，一旧一新有机结合，碰撞出新的火花。

5.2 文章从两个方面分析了LNC942对METTL14的调控，即LNC942影响METTL14mRNA稳定性，LNC942与METTL14 直接结合。

5.3 所有的敲减/过表达实验均在两种细胞系中同时进行，提高实验的准确度和可信度。

该文章虽然在某些方面研究的不够透彻，比如验证了LNC942能维持METTL14的稳定性，但中间的具体作用机制没有作深入探讨；验证了LNC942与METTL14能够相互结合，但未对结合关系影响m6A甲基化水平作研究；确定CXCR4和CYP1B1可能是LNC942介导的METTL14调控的m6A修饰新的候选靶点后，缺少了对于CXCR4和CYP1B1的mRNA m6A甲基化水平的检测。但文章仍不失为一篇经典的lncRNA调控m6A研究的范文，虽然缺少了部分实验，但作者进行了系列回复实验，验证了LNC942通过METTL14的下游靶点CXCR4和CYP1B1影响BRCA进展。大家在后续的标书写作或实际实验操作的时候，一定要确保实验设计的完整性和灵活性，让评审专家无“漏洞”可寻。

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